O MINISTRO DE ESTADO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuição que lhe confere o art. 87, parágrafo único, inciso II, da Constituição, tendo em vista o disposto no art. 2º, inciso VI, do Decreto nº 99.066, de 8 de março de 1990, e o que consta do Processo nº 21000.003648/2007-92, resolve:

Art. 1º Oficializar o método analítico para determinação da razão isotópica do carbono em suco, refresco, néctar e bebida de uva, conforme Anexo da presente Instrução Normativa.

Art. 2º Esta Instrução Normativa entra em vigor na data de sua publicação.

REINHOLD STEPHANES

1. Objetivo do Método:

Determinar a razão isotópica (R) 13C/12C dos açúcares de diferentes origens no suco, refresco, néctar e bebida de uva.

A razão (R) isotópica 13C/12C da amostra é determinada em relação à razão isotópica do padrão internacional PDB e expressa em delta per mil (ä?), de acordo com a equação (1):

(1)

2. Princípio:

Determinação da razão isotópica (13C/12C), por combustão completa dos açúcares, através de um espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS).

Por meio da diluição dos isótopos estáveis do carbono, pode-se mensurar quantitativamente a adição de açúcar-de-cana no suco, refresco, néctar e bebida de uva e outros subprodutos das plantas do ciclo fotossintético C3, uma vez que, a razão 13C/12C é isotopicamente diferente dos produtos e derivados das plantas do ciclo fotossintético C4. O padrão internacional adotado para a análise em delta per mil é o fóssil Bellemnitella americana, da formação Pee Dee do Sul da Carolina, USA, abreviadamente, PDB.

3. Reagentes e padrões

- Hidróxido de Cálcio p.a.

- Ácido sulfúrico p.a. 95% a 98% (m/m).

- Padrão internacional: NBS-22, óleo mineral calibrado pelo NIST (National Institute of Standards & Technology, Gaithersburg) para valor isotópico de carbono em relação ao PDB, tendo valor de ä13C = -29,7 ?;

- Padrão de trabalho: carvão mineral, calibrado em relação ao NBS 22, proveniente do Laboratório de Isótopos Estáveis da UNESP (Botucatu, São Paulo), com valor isotópico de carbono de - 27.99 ± 0.15?.

4. Equipamento e materiais:

- Espectrômetro de massa de razão isotópica com precisão interna de 0,05?, acoplado a um Analisador Elemental e triplo coletor.

- Centrifuga permitindo uma aceleração de 4000rpm.

- Banho-maria permitindo um aquecimento até 90ºC.

- Cápsula de estanho de 3,3x5mm - Agitador magnético - pHâmetro - Vidrarias usuais de laboratório

5. Método experimental:

5.1 Preparo da amostra Centrifugar 50ml de suco (4.000rpm) por 10 minutos, a fim de eliminar os componentes insolúveis. Adicionar ao sobrenadante 2 gramas de hidróxido de cálcio em pó, agitando em agitador magnético durante 5 minutos. Aquecer esta solução, em banho-maria a 90ºC, por 3 minutos. Durante esta etapa, os ácidos orgânicos, os aminoácidos e outros componentes serão precipitados. Centrifugar a solução aquecida (4.000rpm) por 5 minutos para separar os produtos precipitados. Decantar o líquido sobrenadante e acidificá-lo com ácido sulfúrico 2N obtendo um pH de aproximadamente 5, havendo mudança de coloração da solução. Esta solução contém principalmente açúcares, sulfato de cálcio e corantes em menor quantidade.

Eliminar parcialmente o sulfato de cálcio residual, por decantação, conservando a solução em frasco fechado a 4ºC durante aproximadamente 12 horas.

Observação: Nos sucos concentrados, diluir com água destilada até a sua concentração natural.

5.2 Combustão dos açúcares Aproximadamente 1µL da amostra, preparada conforme descrito no item 5.1, é colocado em cápsula de estanho, juntamente com substância absorvente (Cromosorb W), para evitar a volatilização da amostra. O carbono da amostra sofre combustão no interior do analisador elementar em um tubo de quartzo vertical, contendo óxido de cobre e óxido de cobalto e prata a 900ºC, sob fluxo contínuo de hélio ultra puro (90mL min-1). Os gases gerados passam por uma coluna de redução, contendo cobre reduzido a 680ºC e, após retenção de água, são separados por uma coluna cromatográfica Porapak Q a temperatura de 43ºC, antes de chegar na fonte de íons do espectrômetro.

O espectrômetro de massas contém um coletor triplo de íons com o objetivo de medir simultaneamente as relações massa/carga (m/z), correspondentes às massas 44, 45 e 46 do CO2 formado pela combustão das amostras. As amostras são analisadas em triplicata. O desvio padrão para a análise é inferior ou igual a 0,2?.

6. Cálculo dos resultados:

O percentual de açúcar da amostra é calculado através dos valores de ä? 13C analisados, através da equação (2).

(2)

Observação:

1. Os sucos padrões correspondem a sucos genuínos, isentos de adição de açúcar, pertencentes ao banco de dados do Laboratório de Referência Enológica.

7. Parâmetros de validação do método:

- A repetibilidade (r) é igual a 0,04?

- A reprodutibilidade (R) é de 0,05?

- A incerteza de medição é de 0,14?

- A linearidade apresentou um coeficiente de correlação de R2= 0,9997.

8. Referências bibliográficas

AFNOR - ASSOCIATION FRANÇAISE DE NORMATISATION. (1997). Détermination du rapport des isotopes stables du carbone (13C/12C) des sucres contenus dans des jus de fruits. Norme XP ENV 12140. Indice de classement V76-137. Paris.

CEN - COMITE EUROPEEN DE NORMATISATION (1996). Détermination du rapport des isotopes stables du carbone (13C/12C) contenus dans des jus de fruits. Méthode utilisant la spectrometrie de masse des rapports isotopiques. Prénorme Européenne ENV 12140. Bruxelas KOZIET J., ROSSMANN A., MARTIN G.J., ASHURST P. R. (1993). Determination of carbon-13 content of sugars of fruit and vegetable juices. A European inter-laboratory comparison. Analytica Chimica Acta, 271, 31-38. Amsterdam.